基因诊断的名词解释
基因诊断可分为基因直接诊断和基因间接诊断。核酸分子杂交是基因诊断最基本的方法之一。 基因诊断技术它的基本原理是互补的DNA单链能够在一定条件下结合成双链，即能够进行杂交。限制性核酸内切酶是基因工程和基因诊断重要的一类工具酶。它们的发现和应用为从基因组中分离目的基因提供了必要的手段。
基因诊断的分类
基因诊断可分为两类：
基因直接诊断
直接检查致病基因本身的异常。它通常使用基因本身或紧邻的DNA序列作为探针，或通过PCR扩增产物，以探查基因无突变、缺失等异常及其性质，这称为直接基因诊断，它适用已知基因异常的疾病;
基因间接诊断
当致病基因虽然已知但其异常尚属未知时，或致病基因本身尚属未知时，也可以通过对受检者及其家系进行连锁分析，以推断前者是否获得了带有致病基因的染色体。连锁分析是基于紧密连锁的基因或遗传标记通常一起传给子代，因而考察相邻DNA是否传递给了子代，可以间接地判断致病基因是否传递给子代。连锁分析多使用基因组中广泛存在的各种DNA多态性位，特别是基因突变部位或紧邻的多态性位点作为标记。RFLP、VNTR、SSCP、AMP-FLP等技术均可用于连锁分析。
遗传病的基因诊断举例
1.基因缺失型遗传的诊断(1)α地贫的基因诊断：α地贫主要是由于基因缺失引起的，缺失的基因可以由1-4个。正常基因组用BamHⅠ切割，可以得到一个14kb的片段，而缺失一个α基因时切点向5’端移位，得到一条10kb的片段。因此，当用α基因探针与基因组DNA进行Southern杂交时(图13-8)，在α地贫2可见一条14kb和一条10kb的带，在正常人可见一条双份的14kb的带，而在α地贫1则见一条单拷贝的14kb带，血红蛋白H病时只有一条10kb的带的，而在Barts水肿胎时，则无任何杂交带。
一种较简便的方法是直接用α探针进行斑点杂交，自显影后根据斑点深浅的不同也可以对α地贫作出诊断。更为简单的方法是PCR诊断，即在α基因缺失范围内设计一对引物，然后PCR扩增胎儿的DNA，如为Barts 水肿胎，则无扩增产物，电泳后无任何带纹，从而可建议进行人工流产，但此法不能诊断其它类型的地贫(除非另设计引物用作PCR)。
(2)DMD/BMD的缺失型诊断：DMD/BMD是一种Ⅹ连锁隐性遗传的神经肌肉系统受累的致死性遗传病(参阅第四章)。DMD/BMD有70%左右为缺失型。此基因很大，缺失可发生在不同部位，因此应尽可能采用多对引物作PCR扩增(多重PCR)来检测。如扩增产物电泳后发现有带纹的缺失，即可作出诊断并对缺失定位(图13-9)，在进行产前诊断时，一般可先通过检测家系中有关成员，即确定先证者的缺失区，然后有针对性地作PCR扩增，包括缺失部分的两端，以判断胎儿或有关患儿是否也获得了相同的基因缺失，但非缺失型不能用此法查出。
2.点突变型遗传病的基因诊断2(1)镰形细胞性贫血的基因诊断：已知突变基因是编码β珠蛋白链的第6位密码子由GAG变为GTG，从而使缬氨酸取代了甘氨酸，因此可用如下方法进行诊断。
1)RFLP诊断：已知限制酶MstⅡ切割的识别顺序是CCTNAGG，它能切割正常β链中CCTGAGG序列，但不能切割突变了的CCTGTGG(A→T)。这样，由于突变消除了一个切点，使内切酶长度片段发生了改变，通过电泳，就可以区别正常的βA和βS。
2)ASO探针诊断：由于突变部位和性质已完全明了，也可以合成寡核苷酸探针，用32P标化来进行诊断。此时需要合成两种探针，一种与正常βA基因序列完全一致，能与之稳定地杂交;另一种与突变基因序列一致，能与βS基因稳定杂交，但不能与正常的βA基因杂交。根据杂交结果，就可以把发生了突变的βS基因检测出来。
PCR技术问世以来，ASO诊断又有新的改进，即先PCR扩增长约110bp的基因片段，然后再与ASO探针杂交。这样可减少目的基因DNA用量，并降低与基因组DNA杂交时的非特异性信号。
3.基因异常不明的遗传病的诊断 成年型多囊肾病(adult polycystic kidney disease,APKD)是一种常染色体显性遗传病，发病率高，约1000人中有1名致病基因的携带者，起病较晚，多在30岁以后，主要为肾和肝中出现多发性囊肿，临床表现为腰疼、蛋白尿、血尿、高血压、肾盂肾炎、肾结石等，最终可导致肾功能衰竭和尿毒症。本病基因定位在16p13，与α珠蛋白基因3’端相邻，但致病基因尚未克隆，基因产物的生化性质和疾病发病机理也尚未阐明。因此，只能用连锁分析来进行基因的发病前诊断和产前诊断。由于通过家系分析，已证实APKD的致病基因与α珠蛋白基因3’端附近的一段小卫星DNA序列即3’HVR(3’ hypervariable region)紧密连锁，而后者在人群中具有高度多态性，因此可以通过RFLP连锁分析进行诊断。
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基因诊断的基本原理
核酸分子杂交是基因诊断的最基本的方法之一。 基因诊断技术它的基本原理是：互补的DNA单链能够在一定条件下结合成双链，即能够进行杂交。这种结合是特异的，即严格按照碱基互补的原则进行，它不仅能在DNA和DNA之间进行，也能在DNA和RNA之间进行。因此，当用一段已知基因的核酸序列作出探针，与变性后的单链基因组DNA接触时，如果两者的碱基完全配对，它们即互补地结合成双链，从而表明被测基因组DNA中含有已知的基因序列。由此可见，进行基因检测有两个必要条件，一是必需的特异的DNA探针;二是必需的基因组DNA。当两者都变性呈单链状态时，就能进行分子杂交。
一、基因探针基因探针(probe)就是一段与目的基因或DNA互补的特异核苷酸序列，它可以包括整个基因，也可以仅仅是/基因的一部分;可以是DNA本身，也可以是由之转录而来的RNA。
1.探针的来源 DNA探针根据其来源有3种：一种来自基因组中有关的基因本身，称为基因组探针(genomic probe);另一种是从相应的基因转录获得了mRNA，再通过逆转录得到的探针，称为cDNa 探针(cDNa probe)。与基因组探针不同的是，cDNA探针不含有内含子序列。此外，还可在体外人工合成碱基数不多的与基因序列互补的DNA片段，称为寡核苷酸探针。2.探针的制备 进行分子突变需要大量的探针拷贝，后者一般是通过分子克隆(molecular cloning)获得的。克隆是指用无性繁殖方法获得同一个体、细胞或分子的大量复制品。当制备基因组DNA探针进，应先制备基因组文库，即把基因组DNA打断，或用限制性酶作不完全水解，得到许多大小不等的随机片段，将这些片段体外重组到运载体(噬菌体、质粒等)中去，再将后者转染适当的宿主细胞如大肠肝菌，这时在固体培养基上可以得到许多携带有不同DNA片段的克隆噬菌斑，通过原位杂交，从中可筛出含有目的基因片段的克隆，然后通过细胞扩增，制备出大量的探针。
为了制备cDNA 探针，首先需分离纯化相应mRNA，这从含有大量mRNA的组织、细胞中比较容易做到，如从造血细胞中制备α或β珠蛋白mRNA。有了mRNA作模板后，在逆转录酶的作用下，就可以合成与之互补的DNA(即cDNA)，cDNA与待测基因的编码区有完全相同的碱基顺序，但内含子已在加工过程中切除。
寡核苷酸探针是人工合成的，与已知基因DNA互补的，长度可从十几到几十个核苷酸的片段。如仅知蛋白质的氨基酸顺序量，也可以按氨基酸的密码推导出核苷酸序列，并用化学方法合成。
3.探针的标记 为了确定探针是否与相应的基因组DNA杂交，有必要对探针加以标记，以便在结合部位获得可识别的信号,通常采用放射性同位素32P标记探针的某种核苷酸α磷酸基。但近年来已发展了一些用非同位素如生物素、地高辛配体等作为标记物的方法。但都不及同位素敏感。非同位素标记的优点是保存时间较长,而且避免了同位素的污染。最常用的探针标记法是缺口平移法(nicktranslation)。
探针的标记也可以采用随机引物法，即向变性的探针溶液加入6个核苷酸的随机DNA小片段，作为引物，当后者与单链DNA互补结合后，按碱基互补原则不断在其3’OH端添加同位素标记的单核苷酸，这样也可以获得比放射性很高的DNA探针。
二、限制性核酸内切酶(restrictionendonuclease)，又简称限制酶或内切酶。它们是基因工程和基因诊断重要的一类工具酶。它们的发现和应用为从基因组中分离目的基因提供了必要的手段.限制酶能特异地识别和切割特异的核苷酸序列，将双链DNA切成较小的片段。酶切后目的基因可能完整地或部分地保存于某一DNA片段上，并被分离出来。
限制酶主要来源于原核生物，是一组能水解DNA磷酸二酯键的酶。迄今已发现的限制酶多达数百种，分为三类。在基因工程中使用的主要是第二类。限制酶根据其来源命名。
每种限制酶识别和切割的通常为4-6个核苷酸序列，称为限制性位点(restriction sites)或切点。限制酶切割双链DNA的方式有两种，产生的末端也有两种：第一种是交错切割，即两条链的切点不在同一水平而是相隔数个碱基，故断口产生两小段自身互补的单链，这种末端容易互补连接，称为粘性末端(cohesive terminus);第二种为平整切割。
限制酶的上述特性在基因工程和基因诊断中具有重要用途：①首先不论DNA的来源如何，用同一种内切酶切割后产生的粘性末端很容易重新连接，因此很容易将人和细菌或人和质粒任何两个DNA片段连接在一起，即重新组合，这是重组DNA技术的基础。②人类的基因组很大，不切割无法分析其中的基因。限制酶能把基因组在特异的部位切开，即切割不是随机的，因而从每个细胞的基因组得到的是相同的一组长度各异的片段。这些可能含有某一基因的片段可用电泳分离，并加以研究。③由于限制酶的特异性，如果识别位点的碱基发生了改变，限制酶将不再能切割;同样，碱基的改变也可能导致出现新的酸切位点。在人类基因组中，这两种情况是十分常见的，而切点的消失或出现将影响获得的DNA片段的长度，表现为限制性片段长度多态性(RFLP)，这在基因的连锁诊断中具有极重要的意义。
三、限制性片段长度多态性一个人的两套单倍体DNA是不完全相同的，一般每100-500个碱基对就有一个是不相同的。换言之，如果把两套基因组DNA(各3.2×109bp)排列起来，那么平均有1000万处不同，它们多位于内含子序列中。实际上，除单卵双生子外，人群中没有两个个体的基因组DNA是完全相同的。
DNA的多态性虽可通过DNA测序检出，但用限制酶消化却是最常用的检测方法。
1.RFLP由于碱基的变异可能导致酶切点的消失或新的切点出现，从而引起不同个体在用同一限制酶切时，DNA片段长度出现差异，这种由于内切酶切点变化所导致的DNA片段长度的差异，称为限制性片段长度多态性(restriction fragmentlength polymporphism, RFLP)。RFLP反映了常见的个体间DNA核苷酸的可遗传性变异，它按照孟德尔方式遗传。RFLP可用Southern印迹杂交法检出。用Southern杂交检出RFLP时，如探针跨越切点，则被切开的两个片段均可与探针杂交，从而显示两条杂交带。
2.两点RFLP
(1)点多态(point polymorphism)：是由于单个或少数碱基的改变引起酶切点的出现或消失所致的RFLP。上述的RFLP即属于这一类。它们属经典的RFLP。在人类基因组中已发现数以百计的此类多态位点。
(2)数目变异的串连重复(variable number tandem repeats,VNTR)：上述经典的单个碱基取代所致的RFLP一般只能检测到一种杂合性的两种形式，即“有”或“无”某个限制酶切位点，而且每个位点在人群中的杂合子频率通常不会超过50%，当被测个体为纯合状态时，利用RFLP就无法得到所需要的多态信息。此外，在整个基因组中，这类RFLP目前发现的数量还有限，并分布不匀。
但是，在人类基因组中还存在一类DNA重复序列，称为小卫星DNA。它们分布十分广泛，每一个单位通常只有16-28bp长，但其重复次数在人群中是高度变异的。当用限制酶切割VNTR区时，只要酶切点不在重复区内，就可能得到各种长度不同的片段与小卫星DNA不同，另一类重复序列是卫星DNA。它们的基本序列有1-6bp，如(TA)n、(CGG)n等，通常重复10-60次并呈高度的多态性。
VNTR具有高度的变异性，同时也是按照孟德尔方式遗传的，因此是很好的遗传标记，由于它们类型众多和在基因组中分布广泛，因而在基因连锁诊断中应用日益广泛。